Technologia

Opis technologii: Procedura izolacji i namnażania fibroblastów

Izolacja komórek

Procedura izolacji i namnażania komórek odbywa się w warunkach sterylnego laboratorium zgodnie z wymaganiami dobrej praktyki wytwarzania (GMP). Fragment skóry za uchem jest dezynfekowany. Powierzchnia skóry z której ma pochodzić eksplantat zostaje miejscowo znieczulona. Następnie jej fragment (jeden lub dwa) o średnicy 3 mm2 zostaje pobrany i zdezynfekowany z użyciem 70 % roztworu etanolu. Dalej, fragment skóry zostaje umieszczony w szalce Petrie’go z roztworem PBS z dodatkiem antybiotyków, celem oczyszczenia i wypłukania z krwi i tkanki łącznej. Oczyszczony eksplantat zostaje następnie przeniesiony do probówki i jest inkubowany w roztworze enzymów. Enzymy umożliwiają oddzielenie naskórka od skóry właściwej, a także finalnie umożliwiają wyizolowanie fibroblastów z warstwy skóry właściwej. Do naczyń hodowlanych dodawana jest specjalnie opracowana pożywka celem zainicjowania wzrostu komórek w warunkach pozaustrojowych.

Hodowla komórkowa

Komórki zostają wysiane do naczyń hodowlanych w odpowiedniej gęstości. Hodowla komórkowa jest prowadzona w inkubatorze komórkowym z temperaturą 37oC, przy 90 % wilgotności i atmosferze wzbogaconej 5 % CO2. Co dwa lub trzy dni pożywka hodowlana jest wymieniana na świeżą. Hodowla jest prowadzona do uzyskania 80 % konfluencji w maksymalnie drugim pasażu, gdzie uzyskujemy nie mniej niż 30 mln fibroblastów w 1 ml pożywki. Ilość żywych komórek w hodowli jest monitorowana z użyciem licznika komórek TC-20 (Biorad, Polska).
Hodowla fibroblastów prowadzona jest na pożywkach wzbogaconych
o zestaw dodatkowych związków chemicznych, powodujących uzyskanie zwiększonej ilości żywych komórek in vitro bez zmian ich fenotypu (zgłoszenie patentowe).
W trakcie hodowli komórek pożywki hodowlane są na bieżąco testowane pod kątem czystości mikrobiologicznej. Przygotowanie preparatu do iniekcji polega na wielokrotnym odwirowaniu zawiesiny komórek w pożywce i przepłukaniu ich w sterylnym roztworze PBS.

Przygotowanie preparatu zawierającego autologiczne fibroblasty, procedura podania preparatu, analiza skuteczności metody.

Po namnożeniu komórek przygotowuje się gotowy sterylny preparat do iniekcji. Fibroblasty zostają zawieszone w sterylnym roztworze soli fizjologicznej (0.9% NaCl). Podanie komórek zostaje przeprowadzone z użyciem bezciśnieniowego elektrycznego pistoletu do iniekcji (Pistor Eliance). Jest to urządzenie medyczne wyprodukowane zgodnie z Dyrektywą Europejską 93/42/WE, gwarantujące bezpieczeństwo użytkownika oraz pacjenta. Jednorazowo podaje się 2 ml preparatu komórkowego śródskórnie do warstwy brodawkowatej skóry, pod odpowiednim kątem gdzie na 1 cm powierzchni regenerowanej warstwy skóry przypadnie 0,1 ml preparatu. Zostają użyte igły iniekcyjne 27-30 G (BD). Powierzchnia całkowita objęta procesem regeneracji wynosi 20 cm.

Po podaniu komórek pacjenci zostają poinstruowani o zakazie opalania skóry, stosowania filtrów ochronnych przez okres 4 tygodni. Każdy pacjent przed
i dwukrotnie w odstępach 2 i 4 miesięcy od wstrzyknięcia komórek zostaje poddany biometrycznym pomiarom w miejscach wstrzyknięcia komórek celem oceny skuteczności zabiegu.

Cechy skóry, które są analizowane:

  • a. morfologia powierzchni zmiany – skaner 3D Comet LED, Steinbichler, Niemcy.
  • b. ilość i rozmieszczenie chromoforów (melanina i hemoglobina) – system klinicznej dokumentacji fotograficznej Fotomedicus, Elfo, Polska;
  • c. paramenty biomechaniczne – elastyczność, wiskoelastyczność, odkształcenie resztkowe – kutometr MPA 580, Courage-Khazaka, Niemcy.
  • d. parametr bioinżynierii skóry (nawilżenie) – Korneometr CM 825 Courage – Khazaka, Niemcy.
  • e. USG skóry.